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Nature Methods | 何万中實驗室原创开发可克隆电镜标记技术实现细胞中的单分子定位

發布時間:2020/08/13

近50年来,细胞的电镜成像领域依赖基于传统的抗体免疫金标记技术识别细胞中的蛋白质分子。传统免疫金标记技术,受到抗体及抗原的稳定性和特异性、化学固定剂、细胞切片渗透性,胶体金颗粒大小等因素影响,通常标记效率很低(低于10%),甚至无法标记,因此,多数情况只能标记上细胞切片表面的极少部分抗原 。此外, 传统免疫标记需要标记每一个切片,对于细胞组织样品大尺度的标记是十分费钱、费时、费力的工作,比如对神经组织样品的系列切片三维分子水平成像需要对数以千计以上切片进行免疫标记。尽管目前超分辨率荧光显微学成像技术已经可以对细胞中的分子进行单分子水平的成像,但因无法对没有标记的多数分子甚至细胞器成像,通常需要借助于非常复杂低效的光镜-电镜关联成像技术来弥补,而且当分子富集度很高时也无法区分单个分子。


进入基因时代后,细胞生物学家迫切希望电镜领域也能够开发出类似光学显微成像领域广泛应用的 GFP标记,通过遗传操作来直接实现细胞及生物组织的电镜超微结构样品上单个分子的精准识别与定位,因此,可将此类基于遗传编码的标记技术称为可克隆电镜标记技术(或通俗称之为电镜的“GFP”标记技术)。

目前科學家們嘗試了兩類基于遺傳編碼的可克隆電鏡標記技術。


第一类是利用标记蛋白介导释放超氧离子聚合3,3’-diaminobenzenidine后与重金属离子反应形成高电子密度沉淀物示踪,但因为超氧离子扩散速度极快无法实现单个分子定位,只适合相对密闭空间的高浓度标记分子进行展示,例如Alice Ting研究组开发的APEX标记。


第二類是重金屬離子直接與標記蛋白結合形成納米金屬顆粒示蹤,例如富含半胱氨酸的金屬結合蛋白(Metallothionein,簡稱MT;抗凍蛋白AFP等)以及鐵蛋白多聚合體(ferritin),但鐵蛋白多聚合體太大不適合做單分子標記。


2006年David DeRosier研究组首次提出利用纯化的MT蛋白结合金离子可形成纳米金颗粒的特性可用来开发可克隆电镜标记。随后其他几个小组尝试利用MT开发可克隆标记技术,然而受技术限制(如高背景噪声导致特异性差,金离子无法有效进入细胞,合成金颗粒效率低,金颗粒太小等),迄今没有开发出适合细胞超微结构成像的可克隆电镜标记技术。


何万中研究组基于David DeRosier提出的MT标记概念,设计改造MT(MTn,MTα),并尝试了其他富含半胱氨酸蛋白(如抗冻蛋白AFP),开展了可克隆电镜标记技术的研发。经过十年的长期探索积累,何万中研究组攻克了基于富含半胱氨酸的金属结合蛋白的可克隆电镜标记技术的一系列技术挑战,终于研发出适合细胞中单分子识别与精确定位的可克隆电镜标记技术。


其關鍵技術突破簡要介紹如下:


基于Brust-Schiffrin方法(BSM)合成硫醇(RSH)包被的納米金顆粒原理(圖1b),何萬中研究組從研究硫醇陰離子(RS-)濃度與三價金離子(Au3+)的比率(RS-/Au3+)在BSM合成金顆粒的作用入手,發現:傳統的BSM金顆粒合成都是基于RS-/Au3+<2:1條件下會形成不可溶的1:1“之”字型RSAu(I)聚合物,經過強還原劑(NaBH4)還原成Au(0)自成核方式合成納米金顆粒;而當RS-/Au3+≥2:1 条件下则会形成可溶的2:1 RSAu(I)化合物彻底抑制自成核方式纳米金颗粒的合成,称为“自成核抑制机制(ANSM)”。当富含巯基的标记蛋白加入上述BSM反应体系中,系统自身会形成不可溶的1:1“之”字型RSAu(I)聚合物,以及标记蛋白的巯基与金离子形成类似1:1 RSAu(I)的聚合物,二者均可同时称为成核中心合成纳米金颗粒,因而会有相当部分是非标记的背景噪声(图1b(1))。但在自成核抑制机制ANSM条件下,系统自身形成的可溶的2:1 RSAu(I)化合物无法成核,只有标记蛋白的巯基与金离子形成类似1:1 RSAu(I)的聚合物称为成核中心形成纳米金颗粒,从而完全避免了非标记自成核金颗粒背景噪声(图1b(2))。


ANSM金顆粒合成化學原理的關鍵發現,爲後續可克隆標記技術在細胞中的實現與優化奠定了堅實的理論基礎。

圖1.基于遺傳編碼的可克隆電鏡標記技術的開發


a.可克隆电镜标记技术概念图。b.Brust-Schiffrin方法(BSM)合成纳米金颗粒原理,及一价金离子与硫醇的两种结合方式(1:1和2:1模式)。c.经典的BSM合成条件下(1)富半胱氨酸标记蛋白和1:1一价金硫醇盐聚合物均可同时形成金颗粒,何万中研究组发现了一种自成核抑制机制(ANSM)可以在可溶的2:1一价金硫醇盐条件下(2)特异性地在标记蛋白上合成纳米金颗粒(完全抑制非标记自成核金颗粒背景噪声)。d.稳定表达Ost4-GFP-MTn的HeLa细胞的荧光显微像。e.预期Ost4-GFP-MTn蛋白上成功合成纳米金颗粒后在内质网(ER)膜上的定位图。f. 用基于ANSM的可克隆电镜标记技术处理过的HeLa细胞(表达Ost4-GFP-MTn)切片的电镜照片,显示高密度的纳米金颗粒成功定位于朝向细胞质的ER膜上。


何萬中研究組利用獨立新發現的自成核抑制機制(ANSM),成功的開發了一系列針對純化的標記蛋白特異性合成2-6納米大小的金顆粒技術,並證明納米金顆粒是在單個標記分子上形成的。接下來何萬中研究組利用簡單的原核細胞(大腸杆菌系統)摸索優化出細胞中的標記蛋白上特異性合成納米金顆粒的實驗方案,獲得了前所未有超高標記效率(圖2a)。

發現金離子無法大量進入細胞,何萬中研究組首先利用液氮凍裂法優化合成條件,然後優化出低溫甲醇固定通孔獲得優化的超微結構及高效率的金顆粒合成方法,並進一步用化學固定與化學通孔方法進行了方法驗證。然後,何萬中研究組將細菌體系摸索出來的金顆粒合成優化條件拓展至簡單的真核細胞(裂殖酵母)(圖2b,c),發現:真核細胞中需要將還原態的未折疊標記蛋白進行保護巯基免受醛類化學固定劑的破壞才能合成納米金顆粒,探索出氧化保護標記蛋白的巯基方案,並且在化學固定和高壓冷凍固定兩種方案上探索優化出適合酵母的金顆粒合成方案。
最後,何萬中研究組經過不懈的探索,將細菌和酵母中摸索出來的金顆粒合成技術推廣至哺乳動物細胞,攻克了在保證細胞超微結構前提下如何在標記蛋白上高效合成納米金顆粒的難題。


哺乳动物细胞氧化环境下(如ER内腔和线粒体基质)的标记蛋白为折叠状态,酵母的实验方案基本适用。但是哺乳动物细胞中还原环境(如细胞质中)的标记蛋白为未折叠状态,该实验方案标记效率极低且重复率低,经过不断探索,何万中研究组终于研发出了普适性更高更强健的新方案:冷冻替代固定条件下只用鞣酸(tannic acid)与醋酸铀联合低温脱水固定,避免使用巯基氧化剂和醛固定剂,实现保证细胞超微结构下高效合成纳米金颗粒,且不再受标记蛋白折叠状态限制。在HeLa细胞中对ER内腔(图2d),线粒体基质(图2e)及ER膜(朝向细胞质还原环境,图1d-f)三种定位模式的测试,表明:该金颗粒合成方案已经高度成熟有效,重复率极高,可以广泛推广使用。

圖2.可克隆電鏡標記技術在三種模式細胞(細菌,酵母和哺乳動物細胞)中的應用


a.表達MBP-FliG-MTn的大腸杆菌中合成納米金顆粒。b.表達Ost4-GFP-MTα的酵母細胞中納米金顆粒特異性定位于內質網膜(ER)上。c.表達Ost4-GFP-MTn的酵母細胞中納米金顆粒特異性定位于核膜和內質網膜(ER)上。d.穩定表達GFP-MT-KDEL的HeLa細胞中納米金顆粒特異性定位于內質網(ER)內腔中。e.穩定表達Mito-acGFP-MTn的HeLa細胞中納米金顆粒特異線粒體(M)基質中。


此外,何万中研究组发明的基于自成核抑制机制在富含半胱氨酸标记蛋白上合成纳米金颗粒技术,合成条件比较温和,接 近生理条件,还可以用来在纯化的标记蛋白上合成纳米金颗粒,可用来开发一系列新型单分子探针,甚至在cryoEM/CryoET/FIB-SEM均有应用潜力。何万中研究组利用大肠杆菌表达纯化的GFP Nanobody (GBP) 与 MT 标记的融合蛋白 GBP-MT, 去免疫标记细胞中表达的GFP标记蛋白, 展示出该技术可以广泛用来标记目前已有GFP标记的各种细胞及动物组织。


相比基于抗體的傳統免疫電鏡標記技術,何萬中研究組發明的此項基于遺傳編碼的可克隆電鏡標記技術是對細胞電鏡成像領域單分子識別定位的一項重要革新,應該具有廣泛的應用前景。如需了解詳細的研究內容,可以查閱https://www.nature.com/articles/s41592-020-0911-z.,或浏覽在線PDF版本:https://rdcu.be/b6aXc。

從右至左:何萬中,姜招弟,金秀梅,李玉華


我所何万中實驗室PTN项目姜招弟博士生、金秀梅和李玉华为本文的共同第一作者,其他作者包括何万中實驗室刘思彤、赵沛、蔡新斌、刘颖、汤娅琦、孙晓斌、柳燕、胡艳勇、李明博士,杜立林博士及其實驗室的刘晓曼博士、王影影博士生,蛋白质中心陈涉博士及蔡改红,化学中心齐湘兵博士。我所何万中博士为本文通讯作者。该研究由科技部973(2011CB812502、2014CB849902)及北京市政府资助,在北京生命科學研究所完成。


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